51試述核移植的方法 (答全要點給滿分，答不全按4分/項給分)

　　答案：

　　(1)核供體細胞的制備：受精后已發(fā)育到高囊胚或低囊胚的魚卵去膜后，置于底部涂有瓊脂，并盛有Holtfreter氏液的培育皿中，置于解剖顯微鏡下，用玻璃針\發(fā)圈切下位于動物性極的囊胚細胞團，這些細胞在2-3分鐘內(nèi)能分散成游離細胞。如果細胞暫時分不開，可用一支細吸管吸水后輕輕沖擊它們，以幫助細胞分離。

　　(2)受體細胞的制備：移核前，魚卵需先去膜。最常用的方法是用磨尖的不銹鋼鑷子在解剖鏡下剝開卵膜，游離出卵子。剝膜應(yīng)于排卵后2-3分鐘，在盛有消毒水的培育皿中進行。剝粘性卵時，一般只需一手持鑷，用鑷尖夾住卵膜的一處，迅速把膜撕裂，裂口越大越好;剝浮性卵時，卵膜吸水后膨脹，卵周隙很大，所以可用雙手持鑷，同時夾住卵膜上的一處，迅速把卵膜向外撕裂。

　　(3)移核：將分離的的囊胚細胞立即用吸管移至盛有去核卵的培育皿中內(nèi)備用。移核時，把盛有去核卵和分離細胞的培養(yǎng)皿置于解剖顯微鏡下，用發(fā)圈將它們撥到視野內(nèi)，然后將操縱臺移近解剖顯微鏡的一側(cè)，調(diào)節(jié)移動上的位移旋鈕和微型吸管的角度，使之對準分離的囊胚細胞，輕輕向后旋動注射器上的微分筒，該細胞隨培養(yǎng)液被吸入管內(nèi)破裂，但細胞質(zhì)不能分散，應(yīng)仍緊包圍著其中的細胞核，否則細胞核直接與液體接觸會受損傷。細胞被吸入管內(nèi)的位置，以剛進行管口一小段距離為宜，以免將它注入卵時帶入過多的培養(yǎng)液。

　　(4)核質(zhì)雜種的培養(yǎng)：魚類核移植雜種細胞由于卵外膠膜被破壞，需在等滲的Holtfreter液中培養(yǎng)一段時間，然后逐漸轉(zhuǎn)入低滲溶液，早期胚胎發(fā)育過后可入曝氣水中培養(yǎng)。

　　52 試述傳統(tǒng)育種技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)的異同。(每項7分，根據(jù)要點符合程度酌情給分)

　　答案：

　　都是通過獲得優(yōu)良基因?qū)δ繕藙�、植物進行遺傳改良。但在基因轉(zhuǎn)移的范圍和效率上有差別：

　　(1)傳統(tǒng)育種技術(shù)是在生物個體水平上進行，操作的對象是整個基因組，所轉(zhuǎn)移的是大量的基因，不可能準確地對某個基因進行操作和選擇，對后代的預見性差，選出優(yōu)良性狀的概率差。所需時間長，要經(jīng)過數(shù)代不斷選種和繁育，數(shù)年或幾十年才能育成一個優(yōu)良的品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所操作和轉(zhuǎn)移的一般是明確的基因，功能清楚，目的基因被轉(zhuǎn)移到受本后其表現(xiàn)可預測，并在短期內(nèi)表現(xiàn)出人類所期望的遺傳性狀。

　　(2)傳統(tǒng)育種技術(shù)是只能在種內(nèi)個體間實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，血緣關(guān)系較遠的生物間通過傳統(tǒng)的雜交進行基因轉(zhuǎn)移的難度非常大。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因不受生物體間親緣關(guān)系的限制，可有效地避免種間、屬間甚至動植物間物種雜交的不親和，打破了自然繁殖中的種間隔離。通過對動、植物基因組的定向改造，使基因能在種系關(guān)系較遠的機體間流動，大大提高了動、植物品種改良的效率。

　　53如何看待轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物的安全性.(要點均能提到給滿分，未答全的按每要點1.5分給分)

　　答案：

　　(1)轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物的食用安全性

　　安全性檢測問題、滯后效應(yīng)、擔心出現(xiàn)新的過敏原、擔心營養(yǎng)成分的改變;

　　(2)轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)動物的生態(tài)安全性

　　A破壞水域生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和遺傳多樣性�？赡軙�擴散到養(yǎng)殖區(qū)以外，成為野生種類，可能成為“入侵的外來干涉物種”，威脅生態(tài)系統(tǒng)中其他生物的生存，可能重組出對人類或其他生物有害的細菌或病毒;

　　B打破自然物種的原有界限，改變了生態(tài)系統(tǒng)中能量流動和物質(zhì)循環(huán)，重組微生物可能對人類的生活環(huán)境造成二次污染,重組DNA與微生物雜交，可能產(chǎn)生有害的病原微生物。

　　54 試述分子遺傳標記在育種中的應(yīng)用。(答全要點給滿分，答不全按4分/項給分)

　　答案：

　　(1)種群遺傳結(jié)構(gòu)分析：主要表現(xiàn)在親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用、在種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用、在遺傳多樣性中的應(yīng)用

　　(2)預測雜種優(yōu)勢：分子遺傳標記可顯示不同親本組合基因組的差異情況，預測親本的組成差異、親本間的遺傳距離與雜種優(yōu)勢的關(guān)系，為雜交育種中親本的選擇、雜交子代優(yōu)勢預測提供有力的證據(jù)。

　　(3)分子遺傳圖譜的構(gòu)建與基因定位：遺傳連鎖圖譜不僅是遺傳研究的重要內(nèi)容，而且為生物種質(zhì)資源，目標基因克隆、育種等應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。

　　(4)分子遺傳學標記輔助選擇：大多數(shù)水產(chǎn)動物的重要經(jīng)濟性狀是受數(shù)量性狀位點(QTL)和環(huán)境共同作用的。經(jīng)典的遺傳育種研究方法無法區(qū)分一個重要性狀的區(qū)分是由哪一個具體的基因控制的，DNA分子標記為數(shù)量性狀的定位提供了便捷之路。

　　55 根據(jù)水產(chǎn)動物的繁殖方式，遺傳基礎(chǔ)、育成特點將水產(chǎn)動物的品種分成哪三個類型，分述三種品種類型的生產(chǎn)性能及其遺傳基礎(chǔ)。 (答全給滿分，類型 1個項/1分，類型介紹 1項/1分)

　　答案：

　　目前，我國已育成的養(yǎng)殖品種數(shù)量有限，水產(chǎn)養(yǎng)殖品種與植物品種特征相似如：群體數(shù)量大，大群體繁殖、雌雄異體、隨機交配等。根據(jù)水產(chǎn)動物的繁殖方式，遺傳基礎(chǔ)、育成特點將水產(chǎn)動物的品種分成三個類型：

　　(一)群體品種：

　　(1)指品種的繁育群體大，以隨機方式進行繁殖后代的品種，群體內(nèi)多個個體的遺傳基礎(chǔ)具有雜合性。

　　(2)遺傳特點：群體數(shù)量大，隨機交配，雜合度高

　　(3)多數(shù)已育成的水產(chǎn)品種，尤其是多數(shù)自然品種均為群體品種。

　　(二)雜交種

　　(1)指經(jīng)嚴格篩選后配制的雜交優(yōu)勢組合的F1群體。

　　(2)基因高度雜合，群體表現(xiàn)出較強的生產(chǎn)性能優(yōu)勢。雜交種不能穩(wěn)定遺傳，F(xiàn)2代發(fā)生分離，生產(chǎn)性能嚴重下降。

　　(3)雜交種的親本多利用群體品種。目前魚類中利用雜種優(yōu)勢較少，推廣面積也不夠大。

　　(三)純系品種

　　(1)指生產(chǎn)上利用的遺傳基礎(chǔ)基本相同、基因基本純合的品種。

　　(2)水產(chǎn)養(yǎng)殖上的純系品種有兩大類：雌核發(fā)育、高度近交。

　　(3)雌核發(fā)育純系品種一般不會發(fā)生嚴重的混雜和退化。高度近交的純系品種容易發(fā)生混雜，但一般不會因同質(zhì)性造成退化。

　　56. 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物包括哪些主要技術(shù)?(答全給滿分，解釋轉(zhuǎn)基因給3分，技術(shù)每項4分)

　　答案：

　　轉(zhuǎn)基因技術(shù)：是指在DNA操作過程中用到的：重組子構(gòu)建技術(shù)、重組分子導入動植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因在受體細胞染色體上的穩(wěn)定整合及可靠表達技術(shù)。

　　(一)外源基因的構(gòu)建：轉(zhuǎn)移到受體中的外源基因，一般包括三部分：啟動子、目的基因和轉(zhuǎn)錄終止信號。

　　(二)外源基因的導入：顯微注射法，電穿孔轉(zhuǎn)化法，精子介導法，基因槍轉(zhuǎn)化法，病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導法，組織注射法。

　　(三)源基因的檢測，外源基因?qū)�入的檢測包括DNA斑點雜交，PCR陽性檢測技術(shù);外源基因整合的檢測采用Southern技術(shù)，以外源DNA作為探針，進行雜交檢測，可以檢測到外源基因整合到基因組;外源基因表達產(chǎn)物的檢測包括特異性mRNA的檢測，報告基因的酶法檢測，免疫學檢測，表達產(chǎn)物的生物學活性檢測。

　　57 試述轉(zhuǎn)基因技術(shù)中外源基因的導入的常用方法及其優(yōu)缺點。(答全給滿分，方法1項/1分，優(yōu)缺點1項/1分)

　　答案：

　　(一)顯微注射法

　　(1)利用注射儀把外源DNA直接注入動物卵母細胞、受精卵、早期胚胎、胚胎干細胞、或體細胞的轉(zhuǎn)基因方法。

　　(2)優(yōu)點：可準確導入外源基因，轉(zhuǎn)化頻率高，魚體內(nèi)可達20%，不需載體，直接獲得純系，實驗時間短。

　　(3)缺點：儀器貴重，操作繁瑣耗時，一次處理卵很少。

　　(二)電穿孔轉(zhuǎn)化法

　　(1)利用高壓電脈沖作用，使細胞膜上產(chǎn)生可逆的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效導入。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響。

　　(2)優(yōu)點：操作簡單，同時處理大量受精卵。

　　(3)缺點：導入是隨機的、無定向的，轉(zhuǎn)移率低。

　　(三)精子介導法

　　(1)精子同外源DNA共浴后再給卵子受精，使外源DNA通過受精過程進入受精卵并整合于受體的基因組中。

　　(2)優(yōu)點：簡便，成本低，便于大量篩選，是近幾年轉(zhuǎn)基因動物研究的熱點。

　　(3)缺點：處理后精子的受精能力差異較大、陽性率低、轉(zhuǎn)移不穩(wěn)定。

　　(四)基因槍轉(zhuǎn)化法

　　(1)又稱微彈轟擊轉(zhuǎn)化法 ，以高壓氣體為動力，利用高速運行的金屬顆粒轟擊細胞，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨金屬顆粒送入細胞的轉(zhuǎn)化方法。

　　(2)優(yōu)點：該法簡單快速，接觸面積大、轉(zhuǎn)化率高，可同時處理多個個體。

　　(3)缺點：不穩(wěn)定，表達方面存在問題。

　　(五)病毒(噬菌體)顆粒轉(zhuǎn)導法

　　用病毒(噬菌體)DNA(或RT-DNA)構(gòu)建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆體，在體外包裝成病毒(噬菌體)顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶的重組DNA進入受體細胞。

　　轉(zhuǎn)基因病毒具嚴格的宿主特異性，且魚類轉(zhuǎn)基因病毒的分析手段非常落后，此法對魚類暫不適應(yīng)。

　　(六)組織注射法

　　將外源基因直接向機體組織注射，周圍組織能將外源基因納入，并且注入的外源基因能被整合。

　　58 試述外源基因表達產(chǎn)物的檢測方法。(答全給滿分，方法表述1分/1項，方法說明1分/1項)

　　答案：

　　(一)特異性mRNA的檢測

　　Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析，是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。與Southern雜交類似，檢測目的RNA的存在與否及含量。

　　(二)報告基因的酶法檢測

　　(1)報告基因：其表達產(chǎn)物及其功能在未轉(zhuǎn)化的植物細胞中并不存在;其表達產(chǎn)物便于檢測。

　　(2)目前動物基因工程中使用的報告基因一般是編碼酶的基因，主要有：β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT基因)、胸苷激酶基因(cA)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)等。

　　(三)免疫學檢測

　　(1)免疫沉淀法

　　(2)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

　　ELISA是一種利用免疫學原理檢測抗原、抗體的技術(shù)。它與經(jīng)典的以同位素標記為基礎(chǔ)的液-液抗原-抗體反應(yīng)體系不同之處是建立了固-液抗原-抗體反應(yīng)體系，并采用酶標記。

　　抗原或抗體能結(jié)合到固相載體的表面仍保持其活性;抗原或抗體與酶交聯(lián)成酶標抗原或抗體后，仍分別保持其免疫活性和酶活性。酶標抗原或抗體與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，結(jié)合在免疫復合物上的酶遇到相應(yīng)的底物時，可以催化底物的水解、氧化或還原，從而產(chǎn)生有色物質(zhì)。顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)抗體或抗原量相關(guān)。

　　(3) Western印跡法

　　(4)固相放射免疫(RIA)法

　　RIA法是一種定量測定外源表達蛋白的方法。該法具有很高的靈敏度，可檢測出1pg的靶蛋白。

　　(四)表達產(chǎn)物的生物學活性檢測

　　當外源基因的表達產(chǎn)物是一種酶蛋白時，可根據(jù)酶的催化反應(yīng)來確定外源基因的表達與否和表達的程度。常見的有：淀粉酶、堿性磷酸酶、脂肪酶等。