【目的和原理】學習 AChE活性的測定方法 ,觀察中毒前后及使用不同解救藥后 AChE活性的變化。

　　ACh在血液中被 AChE水解，產生醋酸和膽堿。在一定范圍，水解的 ACh量與 AChE的活性成正比。故在反應體系中，加入定量的 ACh使之參加反應，通過測定剩余的 ACh即可計算出水解 ACh的量，從而推算出 AChE活性。

　　ACh的呈色反應

　　ACh可與羥胺反應生成乙酰羥肟酸，后者在酸性條件下與三價鐵離子形成褐色的羥肟酸鐵絡合物，其顏色的深淺可反映 ACh含量。反應過程如下：

　　(1)鹽酸羥胺與氫氧化鈉作用釋放出游離羥胺

　　NH2OH·HCL+NaOH→NH2OH+NaCL+H2O

　　(2) 剩余 ACh與游離羥胺作用，生成羥肟酸化合物

　　(CH3)≡N—(CH2)2OCOCH3+NH2OH→CH3CONHOH +(CH3)3≡N—(CH2)2OH

　　(3)羥肟酸化合物在酸性環(huán)境中與三氯化鐵生成褐色復合物(羥肟酸鐵絡合物)

　　酸性 Fe/3

　　FeCL3+CH3CONHOH

　　CH3CONHO+HCL

　　(棕紅色)

　　【實驗藥品】

　　(1) 7×10-3mol/L氯化 ACh：取 ACh用蒸餾水配成 2.54%溶液，冰箱保存。用前以蒸餾水 20倍稀釋即成 7×10-3mol/L ACh溶液。

　　(2) 1mol/L鹽酸羥胺( NH2OH·HCL)：取 25g鹽酸羥胺，加蒸餾水 359ml，冰箱保存。

　　(3) 3.5N NaOH。

　　(4) 4N HCL。

　　(5) 3.7×10-1mol/L三氯化鐵(FeCL3·6 H2O )：取 10g三氯化鐵，加蒸餾水至 20ml，濃 HCl 0.84ml，加溫溶解，最后加蒸餾水至 100ml制成 3.7×10-1mol/L三氯化鐵(FeCL3 0.1N HCl)溶液。

　　(6) PH7.2的磷酸緩沖液：取Na2HPO4·12H2O16.72g和KH2PO42.72g加蒸餾水至100ml，冰箱保存。

　　【實驗步驟】

　　(1)家兔在給藥前、中毒癥狀明顯后、給atropine待癥狀明顯緩解后、給予 PAM解救后0min、10min、20min、30min等時間點分別由兔耳緣靜脈或股靜脈取血0.5ml，測定 AChE活性。

　　(2)取 20ml試管若干個，按表加入磷酸緩沖液 0.85~1ml，血樣 0~0.15ml，置 37℃±1℃恒溫水浴中預熱 3~5min。

　　(3)加入 7×10-3mol/L ACh溶液 1.0ml(用加樣器)，于 37℃±1℃水浴中反應 40min，每隔 10min搖動一次。

　　(4)反應 40min后立即加入堿性羥胺( 1mol/L NH2OH·HCL與 3.5N NaOH溶液在用前20min等容混合，并不斷震蕩)4.0ml。

　　(5)依次加入 4N HCL和 3.7×10-1mol/L FeCL3各 2ml，每加入一種試劑都要充分振蕩。

　　(6)上述反應液均用濾紙過濾，將濾液倒入比色杯中，以 530nm的波長比色。

　　(7)對照管(標準 ACh值)：為反應體系中全量 ACh對照。

　　空白管：為無血、無 Ach的其它試劑對照。

　　對照管與空白管操作步驟同其它樣品。

　　【實驗結果】

　　1.計算酶活性：全血 AChE活性值以 0.15ml全血在 40min內水解 ACh的μmol數表示

　　(μmol/0.15ml/40min)

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　　OD標準管—OD測定管

　　全血 AChE活性值 = ×7

　　OD標準管

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　　樣本 AChE活性值

　　×100%

　　正常全血 AChE活性值

　　1.繪制時效曲線

　　根據給予 PAM解救后幾個時間點的 AChE活性值制圖。

　　酶活性(%)

　　時間

　　【注意事項】

　　1.Depterex屬于劇毒殺蟲劑，且可從皮膚吸收，如與手等接觸后，應立即用清水清洗。

　　2.給家兔 depterex后，15min仍未出現(xiàn)中毒癥狀，可再追加 1/3劑量的depterex溶液。

　　3.測定 AChE活性時，加入每種試劑時劑量一定要準確。