第四節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué)

　　酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速率和影響此速率的各種因素的科學(xué)。

　　一、酶反應(yīng)速度的測量

　　反應(yīng)的速率也稱速度(velocity)，是以單位時間內(nèi)反應(yīng)物或生成物濃度的改變來表示。測定酶反應(yīng)速度時，一般要求非常高的底物濃度以使實驗測定的起始反應(yīng)速率與酶濃度成正比。以產(chǎn)物的生成量對時間作圖，繪制反應(yīng)過程曲線，不同時間的反應(yīng)速度就是時間為不同值時曲線的斜率。通常采用反應(yīng)的初速度Vo，即以零時點為起點作一與曲線的線性部分相切的直線，這一直線的斜率即等于Vo，這可以避免底物濃度因被消耗而相對降低以及反應(yīng)物堆積等因素對反應(yīng)速度的抑制作用。(產(chǎn)物出現(xiàn)的速率或底物消失速率可根據(jù)特殊波長下吸收光的變化用分光光度計測定。)

　　二、酶濃度對反應(yīng)速度的影響

　　當(dāng)研究某一因素對酶促反應(yīng)速度的影響時，體系中的其他因素保持不變，而只變動所要研究的因素。

　　當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)大于酶濃度時，酶促反應(yīng)速度與酶濃度的變化成正比。

　　三、底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響

　　(一)米-曼氏方程式

　　1913年，Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說進(jìn)行數(shù)學(xué)推導(dǎo)，得出V與[S]的數(shù)學(xué)方程式，即米-曼氏方程式。1925年Briggs和Haldane提出穩(wěn)態(tài)理論，對米氏方程做了一項重要的修正。

　　底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響呈雙曲線。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，V與[S]呈正比關(guān)系(一級反應(yīng));隨著[S]的增高，V的增加逐步減慢(混合級反應(yīng));增到一定程度，V不再增加而是趨于穩(wěn)定(零級反應(yīng))。

　　當(dāng)[S]<< Km 時，v = Vmax [S] /Km，反應(yīng)速度與底物濃度成正比;當(dāng)[S]>> Km 時 ，v≌Vmax，反應(yīng)速度達(dá)到最大速度，再增加[S]也不影響V。

　　(二)Km的意義

　　1.當(dāng)V/v =2時, Km =[S] , Km是反應(yīng)速率v等于最大速率V一半時的底物濃度，單位為摩爾/升(mol/L)。

　　2.Km =K2+K3/K1，當(dāng)K2>> K3時，Km值可用來表示酶對底物的親和力。Km值越小，酶與底物的親和力越大;反之，則越小。

　　3.Km是酶的特征性常數(shù)，它只與酶的結(jié)構(gòu)和酶所催化的底物有關(guān)，與酶濃度無關(guān)。

　　Km和Vmax可用圖解法根據(jù)實驗數(shù)據(jù)測出。通過測定在不同底物濃度下的Vo，再用1/Vo對1/[S]的雙倒數(shù)作圖，又稱Lineweaver-BurK作圖法，即取米氏方程式倒數(shù)形式。

　　四、pH對反應(yīng)速度的影響

　　每一種酶只能在一定限度的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)活力，酶表現(xiàn)最大活力時的pH稱為酶的最適pH。最適pH的微小偏離可使酶活性部位的基團(tuán)離子化發(fā)生變化而降低酶的活性，較大偏離時，維護(hù)酶三維結(jié)構(gòu)的許多非共價鍵受到干擾，導(dǎo)致酶蛋白的變性。

　　酶的最適pH不是固定的常數(shù)，受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖液的種類和濃度等的影響。一般酶的最適pH在4~8之間，植物和微生物體內(nèi)的酶最適pH多在4.5~6.5,而動物體內(nèi)的最適pH多在6.5~8，多在6.8左右。但也有例外，如胃蛋白酶最適pH為1.9，胰蛋白酶的最適pH為8.1, 肝精氨酸酶的最適pH為9.0。Vo對pH的關(guān)系圖形是鐘形曲線。

　　五、溫度對反應(yīng)速度的影響

　　溫度對Vo關(guān)系的圖形是一條曲線，它可清楚地表示出最適溫度。多數(shù)哺乳動物的酶最適溫度在37℃左右，植物體內(nèi)酶的最適溫度在50~60℃。也有些微生物的酶適應(yīng)在高溫或低溫下工作。溫度從兩方面影響酶促反應(yīng)速率，是升高溫度提高反應(yīng)速率和酶遇熱易變性失活兩個相反效應(yīng)間的平衡。

　　六、激活劑對反應(yīng)速度的影響

　　凡能使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)稱為酶的激活劑(activator)。必需激活劑常是金屬離子，如Mg2+、K+、Mn2+等, Mg2+是多種激酶和合成酶的必需激活劑;非必需激活劑是有機化合物和Cl-等，如膽汁酸鹽是胰脂肪酶，Cl-是唾液淀粉酶的非必需激活劑。

　　七、抑制劑對反應(yīng)速度的影響

　　使酶活性下降而不導(dǎo)致酶變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。抑制劑作用有可逆和不可逆抑制兩類。以可逆抑制最為重要。

　　(一) 不可逆抑制作用

　　這類抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心上的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活，一般不能用透析、超濾等物理方法去除。這類抑制作用可用某些藥物解毒，使酶恢復(fù)活性。如農(nóng)藥敵百蟲、敵敵畏、1059等有機磷化合物能特異地與膽堿酯酶活性中心的絲氨酸羥基結(jié)合，使酶失活，導(dǎo)致乙酰膽堿不能水解而積存。迷走神經(jīng)興奮呈現(xiàn)中毒狀態(tài)。解磷定(PAM)可解除有機磷化合物對羥基酶的抑制作用，顯然這類解毒藥物和有機磷農(nóng)藥結(jié)合的強度大于和酶結(jié)合。重金屬鹽引起的巰基酶中毒，可用絡(luò)合劑或加入其他過量的巰基化合物，如二巰基丙醇(BAL)來解毒。

　　(二) 可逆抑制作用

　　這類抑制劑通常以非共價鍵與酶可逆性結(jié)合，使酶活性降低或失活，采用透析、超濾的方法可去除抑制劑，恢復(fù)酶活性�？赡嬉种朴懈偁帯⒎歉偁�、反競爭3種類型，以競爭性抑制研究的最多。三種作用的共同點是因Km和Vmax值的變化導(dǎo)致酶促反應(yīng)初速度下降。競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物類似，且在酶的同一部位(活性中心)和酶結(jié)合，僅在加大底物濃度時才逐漸抵消，顯然Km值要增加，Vmax不變。非競爭性抑制劑不直接影響酶與底物的結(jié)合，酶同時和二者結(jié)合生成的中間產(chǎn)物是三元復(fù)合物，也無正常產(chǎn)物生成，所以Km不變，而Vmax減小。反競爭抑制劑促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，形成的三元復(fù)合物也不能形成正常產(chǎn)物，所以Km變小，Vmax也變小。

　　藥物是酶的抑制劑。競爭性抑制原理應(yīng)用范例是磺胺藥的研制�；前匪幒图�(xì)菌合成葉酸所需的對氨基苯甲酸僅一個碳原子之別(變成了S)，使細(xì)菌的葉酸不能正常合成，導(dǎo)致細(xì)菌的核苷酸合成受阻而死亡。而人以攝入葉酸為主，故磺胺藥對人的核酸合成無影響。