4.(2016·江蘇高考)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復(fù)標注。請回答下列問題：

限制酶 BamHⅠ BclⅠ Sau3AⅠ HindⅢ 識別序

列及切

割位點

圖1

圖2

(1)用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用__________________兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于________態(tài)的大腸桿菌。

(2)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中________________________________________________________________________。

(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接，連接部位的6個堿基對序列為________________________，對于該部位，這兩種酶________(填“都能”“都不能”或“只有一種能”)切開。

(4)若用Sau3AⅠ切圖1質(zhì)粒最多可能獲得________種大小不同的DNA片段。

解析：(1)基因工程中選擇合適的限制酶切割質(zhì)粒和目的基因時，應(yīng)保留目的基因和至少一個標記基因結(jié)構(gòu)的完整性，即遵循“目的基因切兩側(cè)，標記基因留一個”的基本原則，最好選擇切割產(chǎn)生不同末端的兩種限制酶同時切割質(zhì)粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入帶來的不正常表達，因此據(jù)圖分析應(yīng)選擇的限制酶為BclⅠ和HindⅢ，切割后質(zhì)粒上保留的四環(huán)素抗性基因作為標記基因。酶切后的載體和目的基因通過DNA連接酶的作用形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒需要導(dǎo)入Ca2+處理后的處于感受態(tài)的大腸桿菌(處于感受態(tài)的大腸桿菌細胞膜的通透性大大增加，便于重組質(zhì)粒進入)。(2)由上述分析可知，為了篩選出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)先配制含四環(huán)素的選擇培養(yǎng)基，平板上長出的菌落為導(dǎo)入普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌落，進一步鑒定出導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可利用PCR擴增的方式，結(jié)合電泳技術(shù)來分析處理。DNA的兩條鏈是反向平行的，在PCR過程中，當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此應(yīng)選擇引物甲和引物丙。(3)因為BclⅠ和BamHⅠ酶切產(chǎn)生的黏性末端相同，所以可以被DNA連接酶連接，連接部位的6個堿基對序列為，但是連接后形成的DNA中不再具有BclⅠ和BamHⅠ的識別序列，連接部位不能被這兩種酶切開。(4)由圖可知，能被限制酶BclⅠ和BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別并切割，因此圖中質(zhì)粒上存在3個Sau3AⅠ的切割位點，若將3個切割位點之間的DNA片段分別編號為a、b和c，則完全酶切(3個切割位點均被切割)會產(chǎn)生3種大小的DNA片段，即為a、b和c;考慮只切1個切割位點，有三種情況，都產(chǎn)生一種大小的DNA片段，即大小均為a+b+c;考慮切2個切割位點，則會產(chǎn)生a+b、c、a+c、b、b+c、a幾種不同大小的DNA片段。綜上所述，若用Sau3AⅠ識別并切割圖中質(zhì)粒，最多可獲得7種大小的DNA片段，即為a+b+c、a+b、a+c、b+c、a、b、c。

答案：(1)BclⅠ和HindⅢ　連接　感受　(2)四環(huán)素　引物甲和引物丙　(3)

都不能　(4)7

5.多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果膠，使細胞壁破損。成熟的番茄果實PG的合成量顯著增加，能使果實變紅變軟，但不利于保鮮。利用基因工程的方法減少PG基因的表達，可延長番茄的保質(zhì)期�？茖W家將PG基因接到Ti質(zhì)粒上，導(dǎo)入番茄細胞中，得到轉(zhuǎn)基因番茄。請回答下列問題：

(1)轉(zhuǎn)基因番茄的培育過程中涉及的工程手段所依據(jù)的生物學原理是______________________________。對該農(nóng)產(chǎn)品進行銷售時需進行標注，以維護消費者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的__________和__________。一些消費者擔心轉(zhuǎn)基因番茄的安全性，主要表現(xiàn)在________________________________________________________________________

(至少答出一點。)

(2)將PG基因接到Ti質(zhì)粒上，屬于基因工程操作流程中的________________________________________________________________________。

(3)將含有目的基因的番茄細胞培育成轉(zhuǎn)基因番茄植株，需經(jīng)過____________和____________的過程。若想獲得轉(zhuǎn)基因番茄的人工種子，需以植物組織培養(yǎng)得到的______________________________________等為材料，經(jīng)過人工薄膜包裝而得到。

解析：(1)轉(zhuǎn)基因番茄的培養(yǎng)過程用到的工程手段有基因工程和植物細胞工程，應(yīng)用的原理分別是基因重組和植物細胞的全能性;我國的《基因工程安全管理辦法》是為了維護消費者對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)。一些消費者認為不能對轉(zhuǎn)基因食品的安全性掉以輕心，主要表現(xiàn)在擔心出現(xiàn)滯后效應(yīng)、擔心出現(xiàn)新的過敏原、擔心營養(yǎng)成分的改變等。(2)將PG基因接到Ti質(zhì)粒上，屬于基因工程的核心步驟，即基因表達載體的構(gòu)建。(3)植物組織培養(yǎng)過程需經(jīng)過脫分化和再分化過程。所謂人工種子，就是以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)過人工薄膜包裝得到的種子。

答案：(1)基因重組和植物細胞的全能性　知情權(quán)　選擇權(quán)　擔心出現(xiàn)滯后效應(yīng)(或擔心出現(xiàn)新的過敏原、擔心營養(yǎng)成分改變等)　(2)基因表達載體的構(gòu)建　(3)脫分化　再分化　胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽

考點二 克隆技術(shù) 6.研究小組用土壤農(nóng)桿菌與陸地棉葉肉細胞原生質(zhì)體共同培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)基因陸地棉，過程如下。請回答下列問題：

(1)圖a表示從已經(jīng)消毒的葉片中剪取部分植物組織細胞，圖b表示制備原生質(zhì)體，培養(yǎng)皿中要加纖維素酶和果膠酶，其原因是_____________________________________________。

(2)圖c表示用培養(yǎng)基培養(yǎng)原生質(zhì)體，培養(yǎng)基中加入了適宜濃度的蔗糖，其主要作用是_____________________和__________________。培養(yǎng)一段時間后，將其與土壤農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，使重組Ti質(zhì)粒進入________________，重組Ti質(zhì)粒上______________段攜帶了目的基因，可以整合到植物細胞的 __________________上。然后通過離心(圖d)的方法，除去多余的土壤農(nóng)桿菌。

(3)圖e表示將原生質(zhì)體培養(yǎng)成愈傷組織，然后將其轉(zhuǎn)移到含有一定抗生素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(圖f)，抗生素的作用是_______________________________。

(4)將愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(圖g)，同時注意調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和含量，其原因是______________________________________，最終獲得完整的植株(圖h)。

解析：圖示是通過土壤農(nóng)桿菌與植物細胞原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法獲得轉(zhuǎn)基因植物的過程。a為獲取植物細胞;b為去除細胞壁獲取原生質(zhì)體的過程;c為用培養(yǎng)基培養(yǎng)原生質(zhì)體;d為土壤農(nóng)桿菌與植物細胞原生質(zhì)體共培養(yǎng);e表示脫分化過程;f表示用選擇培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng);g表示再分化過程;h表示轉(zhuǎn)基因植物幼苗。(1)圖b表示用纖維素酶和果膠酶兩種酶來制備原生質(zhì)體，原因是植物細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，纖維素酶和果膠酶可除去細胞壁。(2)圖c表示用培養(yǎng)基培養(yǎng)原生質(zhì)體，培養(yǎng)基中加入了適宜濃度的蔗糖，其主要作用是為原生質(zhì)體提供碳源和能源和調(diào)節(jié)滲透壓維持原生質(zhì)體的形態(tài)，將其與土壤農(nóng)桿菌共同培養(yǎng)，使攜帶目的基因的Ti質(zhì)粒的T­DNA進入植物細胞，整合到植物細胞的染色體(染色體DNA)上，然后通過離心的方法，除去多余的土壤農(nóng)桿菌。(3)圖e表示將原生質(zhì)體培養(yǎng)成愈傷組織，然后將其轉(zhuǎn)移到含有一定抗生素的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(圖f)，抗生素的作用是篩選出含目的基因的植物細胞。(4)植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和含量會影響愈傷組織的分化，故將愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(圖g)，同時注意調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和含量。

答案：(1)植物細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，纖維素酶和果膠酶可除去細胞壁　(2)為原生質(zhì)體提供碳源和能源　調(diào)節(jié)滲透壓維持原生質(zhì)體的形狀　原生質(zhì)體(植物細胞)　T­DNA　染色體(染色體DNA)　(3)篩選出含目的基因的植物細胞　(4)植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和含量會影響愈傷組織的分化